S Streprococcus mutans dan Streptococcus sanguinis adalah mikroorganisme yang merupakan penyebab karies gigi. Probiotik Lactobacillus reuteri dilaporkan memiliki sifat antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh probiotik L. reuteri khususnya strain Indonesia, baik dengan maupun tanpa penambahan gliserol, terhadap pertumbuhan massa biofilm S. mutans, S. sanguinis, dan multispesies. Penelitian dilakukan dengan metode biofilm assay. S. mutans ATCC 25175 dan S. sanguinis ATCC 10556 dikultur dengan BHI broth, kemudian didistribusikan kedalam 96 well-plate dan di inkubasi selama 24 jam dalam suasana anaerob. L. reuteri LC 382415 dikultur dengan MRS broth, kemudian dibagi menjadi dua kelompok, yaitu L. reuteri dengan gliserol dan L. reuteri tanpa gliserol, kemudian diencerkan hingga mencapai konsentrasi berbeda-beda (1x108, 1x106, dan 1x104 CFU/mL). Kultur tersebut didistribusikan ke dalam well-plate dan diinkubasi selama 1 jam, 3 jam, 6 jam, 24 jam. setelah itu optical density diukur menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 490 nm. Hasil dari penelitian yang dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA one way dan Post-hoc HSD menunjukkan jika dibandingkan dengan kontrol negatif, rerata massa biofilm menurun secara signifikan disetiap konsentrasi dan waktu inkubasi untuk kedua biofilm monospesies dan multispesies . Dengan demikian, setiap konsentrasi L. reuteri LC 382415 mampu menghambat pertumbuhan massa biofilm dan L. reuteri dengan penambahan gliserol terlihat lebih signifikan dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. mutans, S. sanguinis, dan multispesies dibandingkan dengan L. reuteri tanpa gliserol.