L Latar belakang: lipoteichoic acid (LTA) merupakan salah satu faktor virulensi yang terkandung pada dinding sel bakteri Enterococcus faecalis. Komponen ini dapat menginduksi proses inflamasi dan memicu peningkatan kadar sitokin inflamatoris seperti tumor necrosis factor- alpha (TNF-α), sehingga menyebabkan infeksi endodontik persisten. Klorheksidin glukonat 2% (CHX) merupakan irigan yang dapat melemahkan ikatan LTA E.faecalis. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu dan waktu inkubasi klorheksidin glukonat 2% terhadap kadar TNF-α Bahan dan Metode: Penelitian ini dibagi menjadi 8 kelompok uji. Besar sampel yang digunakan sebanyak dua kali pengulangan (n= 2). Penelitian ini menggunakan sel makrofag Mus musculus yang diberikan paparan LTA E.faecalis (ATCC 29212) di dalam microplate selama 1 jam. Klorheksidin glukonat 2% dipanaskan di dalam inkubator hingga suhu 250 C dan 370 C, kemudian larutan tersebut diberikan sebanyak 1 ml pada masing-masing plate dengan waktu inkubasi tertentu yaitu 2 menit dan 5 menit. Dua kelompok uji terakhir merupakan kelompok dengan irigasi campuran NaOCl 5%, Aquades dan CHX 2% dengan waktu inkubasi dan suhu yang sama seperti pada plate sebelumnya. Kadar TNF-α diukur secara kuantitatf dengan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Data dianalisis menggunakan uji ANOVA dua arah dan uji multipel komparasi Tuckey. Hasil: Terdapat perbedaan bermakna pada variabel suhu klorheksidin glukonat 2% (p< 0,05) pada kadar TNF-α yang terbentuk dan tidak terdapat perbedaan bermakna pada variabel uji waktu inkubasi pada kadar TNF-α yang terbentuk. (p> 0,05). Kesimpulan: Suhu klorheksidin glukonat 2% memiliki pengaruh terhadap kadar TNF-α.