B Berdasarkan Riskesdas 2013 menunjukkan prevalensi penyakit periodontal di Indonesia cukup tinggi yaitu 95,21% pada responden usia > 15 tahun. Bakteri Porphyromonas gingivalis dan Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang membentuk biofilm dapat menyebabkan penyakit periodontal. Tea tree oil (Melaleuca alternifolia) (TTO) diketahui mempunyai sifat anti-inflamasi, antibakteri, antifungi, dan antivirus. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek hambat TTO terhadap perlekatan biofilm P. gingivalis dan A. actinomycetemcomitans pada permukaan email gigi secara in vitro. Pada penelitian ini kultur dari P. gingivalis ATCC 33277 dan A. actinomycetemcomitans ATCC 29522 diinkubasi dalam BHI broth 24 jam, 37qC, dalam suasana anaerob, kemudian gigi yang sudah ditempatkan pada 24-well culture plate diinokulasi dengan P. gingivalis atau A. actinomycetemcomitans masing-masing sebanyak 2mL dan diinkubasi selama 48 jam untuk membentuk biofilm. Setelah itu TTO dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56% diberikan ke gigi di dalam well, kemudian efek hambat diobservasi dengan masa inkubasi 1 jam dan 3 jam. Jumlah biofilm dihitung dengan dikultur pada BHI agar selama 24 jam lalu dihitung jumlah koloni per masing-masing konsentrasi dalam satuan CFU/mL. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya penurunan jumlah koloni bakteri setelah diberikan TTO. Konsentrasi terbaik TTO yang dapat menghambat perlekatan biofilm P. gingivalis adalah pada konsentrasi 12,5% dengan masa inkubasi 1 jam dan untuk biofilm A. actinomycetemcomitans adalah pada konsentrasi 3,12% dengan masa inkubasi 3 jam. Hasil uji one way Anova dan uji Post Hoc LSD menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p < 0,05) antara konsentrasi TTO dengan kontrol negatif. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa TTO mampu menghambat perlekatan biofilm P. gingivalis dan A. actinomycetemcomitans pada permukaan email gigi dan berguna sebagai alternatif pengobatan penyakit periodontal.