S Streptococcus mutans dan Aggregatibacter actinomycetemcomitans mempunyai peran penting dalam pembentukan karies gigi dan penyakit periodontal. Kefir adalah minuman susu fermentasi yang mempunyai banyak manfaat. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa kefir memiliki fungsi antimikroba, antikariogenik, aktivitas imunomodulator dan juga meningkatkan pencernaan laktosa. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek hambat susu kefir terhadap pertumbuhan biofilm monospesies dan multispesies bakteri patogen S. mutans dan A. actinomycetemcomitans. Kultur dari S. mutans ATCC 25175 dan A. actinomycetemcomitans Y4 diinokulasi ke dalam BHI broth kemudian diinkubasi selama 24 jam, 37oC, suasana anaerob. Bakteri distandardisasi hingga OD mencapai 0.25-0.3 (1x107 CFU/mL). Kefir dengan konsentrasi yang berbeda (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%) didistribusikan ke dalam well yang mengandung biofilm. Efek hambat diobservasi setelah inkubasi 1 jam, 3 jam, 6 jam, dan 24 jam. Pewarnaan bakteri menggunakan kristal violet (0,5%w/v) untuk S. mutans dan safranin (0,5%w/v) untuk A. actinomycetemcomitans. Kemudian jumlah biofilm dihitung menggunakan ELISA reader pada 450nm dan 490nm dengan menambahkan 90% etanol sebanyak 200 µL kedalam well. Terjadi penurunan optical density (OD) setelah diinkubasi. Konsentrasi terbaik dalam menghambat biofilm S. mutans adalah kefir 100% dengan 6 jam inkubasi, untuk A. actinomycetemcomitans adalah kefir 50% dengan 24 jam inkubasi, dan untuk multispesies adalah kefir 50% dengan 3 jam inkubasi. One Way ANOVA menunjukan ada perbedaan yang signifikan (p < 0,05) pada hampir setiap konsentrasi dan masa inkubasi. Penelitian ini menunjukan bahwa kefir memiliki aktivitas antibiofilm terhadap S. mutans dan A. actinomycetemcomitans yang dapat berguna terhadap pencegahan terapi baru untuk mencegah karies dan penyakit periodontal.