K Karies dan penyakit periodontal diawali dengan terbentuknya biofilm oleh bakteri seperti Streptococcus mutans dan Porphyromonas gingivalis. Secara farmakologi disebutkan bahwa sambiloto mempunyai sifat antibakteri, antifungal, antivirus, antiinflamasi, antioksidan, analgesik, imunostimulator, dan antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek hambat ekstrak sambiloto terhadap pertumbuhan biofilm monospesies serta multispesies S. mutans and P. gingivalis secara in vitro. Kultur dari S. mutans ATCC 25175 dan P.gingivalis ATCC 33277 didistribusikan ke dalam well-plate ketika optical density mencapai 0,25 – 0,3 (1x107 cfu/mL). Ekstrak sambiloto diencerkan dengan DMSO 10% hingga terbentuk konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% dan 6,25% dan ditambahkan ke dalam well-plate. Efek hambat diobservasi setelah 1 jam, 3 jam, 6 jam, dan 24 jam. Ekstraksi dari kristal violet dan safranin yang masih berada dalam well dihitung sebagai jumlah biofilm dengan menggunakan ELISA reader pada 450 nm and 490 nm dengan menambahkan etanol 90% sebanyak 200 L. Terdapat penurunan optical density dari biofilm setelah diberikan ekstrak sambiloto. Konsentrasi terbaik dalam menghambat biofilm S. mutans adalah ekstrak sambiloto 100% dengan inkubasi 6 jam, untuk P. gingivalis adalah ekstrak sambiloto 100% dengan inkubasi 1 jam, dan untuk multispesies adalah ekstrak sambiloto 100% dengan inkubasi 3 jam. Hasil uji one way Anova and Tukey HSD menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p < 0,05) pada beberapa konsentrasi dan masa inkubasi. Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak sambiloto memiliki efek hambat terhadap pertumbuhan biofilm S. mutans dan P. gingivalis yang berguna untuk pencegahan karies dan penyakit periodontal.