I Insidensi penyakit periodontal di Indonesia mencapai 96.58%. Bakteri spesifik penyebab periodontitis agresif adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Kelopak bunga rosella mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, dan glikosida yang memiliki sifat antibakteri, antihipertensi, antiinflamasi, antikanker, dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya pengaruh ekstrak etanol kelopak bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L. ) terhadap densitas biofilm A. actinomycetemcomitans secara in vitro. Kelopak bunga rosella dalam penelitian ini diambil dari Balitrro di Bogor, Jawa Barat. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium MiCore FKG Usakti. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan metode uji biofilm yang menggunakan klorheksidin 0.2% sebagai kontrol positif, dan BHI- broth (Brain Heart Infusion- Broth) sebagai kontrol negatif. Ekstrak etanol kelopak bunga rosella diencerkan dengan BHI untuk mendapatkan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25% 3.12%, dan 1.5%. Penelitian dilakukan dengan menginkubasi wellplate selama 1 jam, 6 jam, dan 24 jam dalam suasana anaerob kemudian membaca OD (optical density) dengan microplate reader pada panjang gelombang 490nm. Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan OD setelah diberikan ekstrak etanol kelopak bunga rosella. Uji normalitas menunjukkan bahwa sebaran data normal (p>0.05). Uji ANOVA satu jalan menunjukkan perbedaan yang signifikan antar variabel (p<0.05). Uji Post-Hoc menunjukkan perbedaan yang bermakna antar konsentrasi ekstrak etanol kelopak bunga rosella. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol kelopak bunga rosella dapat menghambat biofilm A. actinomycetemcomitans secara in vitro. Konsentrasi 1.5% pada masa inkubasi 1 jam, dan konsentrasi 3.12% pada masa inkubasi 6 jam dan 24 jam terbukti lebih efektif daripada klorheksidin 0.2% dengan perbedaan bermakna untuk menghambat pertumbuhan biofilm A. actinomycetemcomitans