L Latar Belakang: Madu yang berasal dari lebah Trigona spp. telah dikenal dengan berbagai khasiatnya dalam kesehatan dan memiliki potensi bahan alami yang dapat digunakan sebagai upaya preventif untuk menghambat dan membunuh bakteri utama pada penyakit karies gigi yaitu Streptococcus mutans. Penelitian terdahulu telah melaporkan bahwa madu alami memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S.mutans dalam mencegah karies gigi. Tujuan: Menguji aktivitas madu Trigona spp. terhadap aktivitas antibakteri S.mutans. Metode: Penelitian eksperimental laboratorik dengan rancangan post-test only control group design secara in vitro menggunakan metode dilusi cair. Bahan uji madu trigona raw, madu trigona dehum, hydrosol honey, serta klorheksidin 0,2% (kontrol positif) dan akuades (kontrol negatif). Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan cara menghitung total koloni bakteri dengan rumus total koloni bakteri. Hasil: Menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada madu trigona raw, madu trigona dehum dan hydrosol honey dalam menghambat bakteri S.mutans. Aktivitas antibakteri pada madu trigona raw memiliki perbedaan signifikan terhadap S.mutans dengan jumlah total koloni 0,4x10^6 CFU/mL dibandingkan dengan madu trigona dehum dan hydrosol honey. Analisis Kruskal-Wallis menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dalam menghambat S.mutans. Kesimpulan: Pada madu trigona raw, madu trigona dehum dan hydrosol honey menunjukkan adanya perbedaan nilai pada aktivitas antibakteri S.mutans sehingga pemanfaatannya sebagai upaya preventif dalam menghambat bakteri S.mutans perlu dipertimbangkan.