A Asam asetat meaipakan salah satu asam yang dikonsumsi oleh masyarakat. Pada email gigi, asam asetat dapat menyebabkan proses demineralisasi. Untuk menurunkan proses demineralisasi, kitosan adalah salah satu bahan alam yang dapat mempengaruhi kondisi asam dalam rongga mulut. Kitosan dapat ditemukan dalam kumbang tanduk (Xylotrupes gideon). Kumbang tanduk (Xylotrupes gideon) diketahui merugikan manusia Akan tetapi dapat dimanfaatkan oleh manusia dengan mengolah menjadi kitosan dan kalsium dalam bentuk nano partikel. Penelitian eksperimental (in vitro) ini, bertujuan untuk mengetahui pengaruh campuran nano kitosan dan nano kalsium Xylotrupes gideon terhadap kekerasan email gigi. Penelitian ini menggunakan sampel gigi premolar 1 rahang atas dengan jumlah 36 gigi, disimpan setelah perawatan ortodonti yang membutuhkan ekstraksi dari pasien dengan usia 14- 18 tahun. Kemudian dibagi 4 kelompok, yaitu AO sebagai kontrol negatif (saliva artifisial), A1 sebagai kontrol positif (saliva artifisial dan perlakuan menggunakan larutan asam asetat), A2 dengan pretreatment nano kitosan dan perlakuan seperti kelompok Al, dan A3 dengan pretreatment campuran nano kitosan dan nano kalsium dan perlakuan seperti kelompok Al. Pada kelompok A2 dan A3 dibagi menjadi 3 subkelompok dengan kadar 4000 ppm, 6000 ppm, dan 8000 ppm. Kekerasan email gigi diukur sebelum dan sesudah dilakukan perlakuan selama 7 hari, dengan menggunakan uji Vickers Hardness. Hasil uji One-way Anova menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0.05) pada kelompok kontrol positif dan kontrol negatif dengan kelompok yang diberikan pretreatment nano kitosan dan campuran nano kitosan dan nano kalsium. Campuran nano kitosan dan nano kalsium terdapat kenaikan selisih rerata kekerasan email gigi sebesar 43,11% dibandingkan dengan kelompok nano kitosan. Pada hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan nano kalsium pada nano kitosan mampu meningkatkan kekerasan email gigi lebih besar dibandingkan dengan hanya diberikan nano kitosan.