L Latar Belakang: Prevalensi penyakit gigi dan mulut yang terjadi di Indonesia padatahun 2018 sebesar 57,6%. Salah satu bakteri penyebab penyakit di rongga mulutadalah Staphylococcus aureus. S. aureus merupakan salah satu bakteri penyebabinfeksi pada saluran akar. Bahan irigasi yang efektif untuk menghilangkan S. aureusadalah klorheksidin, tetapi penggunaan klorheksidin dapat menimbulkan suatureaksi alergi. Tumbuhan sarang semut memiliki senyawa aktif seperti flavonoid,tanin, saponin, terpenoid, dan fenol yang berperan sebagai antibakteri. Tujuan:Mengetahui efek ekstrak sarang semut dalam menghambat pertumbuhan biofilm S.aureus. Metode: Pembuatan kultur bakteri dengan cara memasukkan bakteri S.aureus ke dalam BHI broth dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam,selanjutnya pembuatan biofilm S. aureus dengan cara kultur S. aureus didistribusikan ke dalam 96-wellplate dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.Tahap selanjutnya dilakukan pengenceran ekstrak sarang semut pada konsentrasi100% menggunakan DMSO 20% hingga terbentuk ekstrak dengan konsentrasikonsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, dan 0,78%. Uji biofilm S.aureus terhadap ekstrak sarang semut menggunakan biofilm assay dengan waktukontak 15 dan 30 menit. Pengujian biofilm dilakukan pengulangan lima kali dananalisa hasil dilakukan dengan menggunakan microplate reader pada panjanggelombang 592nm. Hasil: Ekstrak sarang semut dapat menghambat pertumbuhanbiofilm S. aureus pada masa inkubasi 15 dan 30 menit. Hasil statistik menggunakanuji ANOVA satu jalan dan uji Post Hoc LSD yang menunjukkan adanya perbendaanbermakna (p<0,05). Kesimpulan: Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstraksarang semut mempunyai daya hambat terhadap biofilm S. aureus dan dapatberguna sebagai bahan aktif obat irigasi saluran akar.